그람염색(Gram Staining)

: 각종 균을 염색하여 현미경적으로 관찰하며 감염질환의 조기진단에 이용된다.

▶ 검사원리

그람염색법은 1884년 Hans Christian Gram에 의해서 처음으로 개발된 방법으로 각종 검체 및 배양집락의 현미경적 검사에 이용되며 미생물에 의한 감염여부를 조기에 진단할 수 있게 해준다.

세균을 crystal violet의 염료로 염색시킨 후에 알코올로써 탈색시키는 동안에 crystal violet의 자주색이 탈색되면 그람 음성으로, 탈색되지 않고 자주색이 남아있어서 관찰이 잘 되면 그람 양성으로 정의하고 있다. 그람 음성은 알코올로써의 탈색처리가 끝나고 붉은 색의 safranin으로 대비염색(counter staining)시켜보면 분홍색으로 염색되는 것이 특징이다. 그람양성 세균이 왜 알코올에 의하여 탈색되지 않는가 하면 그것은 crystal violet 염색 직후에 매염제(mordant)를 사용하기 때문이다. 매염제로서 요오드용액 (I₂-KI)을 사용하는데 이 용액은 세균 세포내의 RNA, Mg⁺⁺, crystal violet과 결합하여 알코올에 대하여 저항성을 가짐으로써 탈색되지 않는 것으로 알려지고 있다. 한편, 그람 음성세균은 이러한 반응이 이루어지지 않으므로 crystal violet이 탈색된다.

(그람염색은 각 세균의 세포벽을 이루고 있는 성분과 구조에 따라 다르게 나타나는데 그람양성세균의 경우 세포벽이 두꺼운 peptidoglycan layer와 풍부한 teicoic acid로 이루어져 있어서 organic decolorizer(탈색제)로 탈색시 쉽게 탈색되지 않으며 따라서 염색액 crystal violet이 계속 세균내에 남아있어 보라색으로 염색된다. 반면 그람음성세균은 peptodoglycan layer가 단일층으로 되어 있으며 세포벽이 지방성분이 풍부한 lipopolysaccharide(LPS)로 이

루어져 있어 organic decolorizer(탈색제)에 의해 crystal violet이 쉽게 탈색되며 따라서 대조 염색액인 safranin O로 염색되어 붉은색을 나타낸다.)

이 염색법은 당초의 목표와는 달리 세균의 분류에 이용되기도 하였다. 그후 양성□음성균은  화학요법제에 대한 감수성뿐만 아니라, 균의 증식에 필요한 영양소의 종류, 물리□화학적 자극에 대한 반응, 생산하는 독소, 병변 등 각 방면에서 차이가 있다는 것을 알게 되면서 그람염색법의 의의는 증대하였다.

< 그람 음성균 >

그람염색법으로 염색하였을 때 자주색은 탈색되고 사프라닌으로 붉게 염색되는 세균. 그 종류로는 살모네라균, 이질균, 티푸스균, 대장균, 콜레라균, 페스트균, 임균, 수막염균, 스피로헤타 등이 포함된다. 일반적으로 트리페닐메탄계나 아크리플라빈 색소에 대한 저항력이 강하고 계면활성제에도 내성이 강하다. 또 생존에 필요한 영양요구가 간단하여 단순한 구성의 배양액에서도 잘 자라며, 독소는 균체내 독소로 가열에 의해서도 잘 파괴되지 않는다. 균체 항원의 주체가 되지만 면역성은 약하다.

< 그람 양성균 >

그람 염색법에 의하여 자주색으로 변하는 세균. 즉, 포도상구균, 연쇄상구균, 폐렴균, 나병균, 디프테리아균, 파상풍균, 탄저균, 방선균 등이 여기에 속한다. 색소나 약제에 대한 감수성이 높으며, 대사 작용에는 아미노산과 비타민을 필요로 한다. 균체외 독소를 방출하는데 이 독소의 독작용은 균종에는 강력하지만 가열하게 되면 쉽게 파괴된다. 이 독소는 생체내에서 항원성이 높고, 생성된 항체는 독소와 결합하여 그 독성을 중화시키는 특이성을 가지고 있다. 그 밖에 외독소에 포르말린을 작용시키게 되면 독성은 없어지고 항체만 남게 되므로 면역원으로 이용할 수 있다.

양성과 음성은 전기적 성질과는 무관하며 단순히 형태학적 차이를 나타내는 용어이다. 그람양성균과 음성균이 서로 다르게 염색되는 것은 근본적으로 세포벽구조가 다르기 때문이다. 세균의 세포벽은 크기와 형태를 유지하게 하며 또한 삼투압에 의한 세포파열을 방지하는 역할을 한다. 세포벽에는 peptidoglycan이 있기 때문에 아주 단단하다. 양성균의 세포벽은 여러층의 peptidoglycan층이 두껍게 감싸고 있는데 세포벽의 약 80~90%가 peptidoglycan이다. 반면, 음성균은 peptidoglycan층이 한겹으로 얇으며, 이층 외부에는 인지질, 리포폴리사카이드, 리포프로테인 등으로 구선된 outer membrane이 감싸고 있는 형태로 세포벽이 이루어졌다.

(그람양성균의 CV-I복합체가 탈색되지 않는 이유는 탈색제로 사용되는 알코올이 여러 층의 peptidoglycan을 탈수시켜 분자간의 공간을 좁히기 때문에 CV-I복합체가 cell밖으로 빠져나오지 못하는 것이다. 그러나 그람 음성균은 대부분 인지질로 구성된 외막과 cytoplasmic membrane이 알코올에 쉽게 용해되며, 얇은 peptidoglycan 층은 CV-I복합체를 막기 곤란하기 때문에 염색된다.)

▶ 실험방법

① 균 준비

② Slide glass를 알코올 램프 불꽃에서 잠깐 동안 가열시켜서 유막을 제거한다.

③ Slide glass 위에 DW(증류수)를 1-2방울 떨어뜨린다.

④ 배양 중인 세균을 이쑤시개를 이용해 증류수에 넓게 편다.

⑥ 알코올램프를 이용하여 고정한다.

⑦ 완전히 건조가 되면 Crystal violet으로 1min 동안 염색 ⇒ 증류수로 세척

⑧ Iodine으로 1min 동안 처리 ⇒ 증류수로 세척

※ 조심해서 다룰 것! 독성이 있음.

⑨ 95% Ethanol로 7초간 처리 탈색 ⇒ 증류수로 세척

※ 이 단계에서는 Ethanol을 너무 오래 처리하게 되면 탈색이 되어 Gram (+)와 (-)를 분별하는데 어려움이 생긴다. 양성균이 음성균으로 나올 수 있다.

⑩ Safranin으로 1min 동안 염색 ⇒ 증류수로 세척

⑪ 공기 중에서 건조한다.

⑫ 현미경으로 저배율부터 관찰한다.

① Primary stain - Crystal violet : 모든 세포들은 보라색으로 염색됨.

② Mordant - Gram Iodine : crystal violet을 세포에 강하게 고정시키기 위해 사용됨.

③ Decolorizing agent - 95% Ethanol : 탈색제로 지방용해와 단백질 탈수작용

G(+) - 지방의 함유가 낮아서 탈수가 적다.

G(-) - 지방의 함유가 많고 단백질의 탈구가 일어나, 세포벽은 무색이 됨.

④ Counterstain - Safranin : 이미 탈색된 세포를 빨간색으로 염색