13주차 생명과학 실험- Agarose gel 전기영동 (Electrophoresis)

실험방법

- Agarose gel (1%) 만들기.

① 삼각플라스크에 1% Agarose를 넣고 1X TAE buffer를 넣어준다. (2g agarose, 200ml TAE)

② 네임펜으로 물높이를 표시하고 agarose가 완전히 녹을때까지 전자렌지에 돌려준다. (1-2분)

(용기의 용량에 비해 많은 양을 넣어 끓어 넘치거나 폭발하지 않도록 주의할 것. 절대 주의!)

③ 증발된 만큼 증류수를 넣어 물높이를 맞춘 후 뜨겁지 않을 때까지 실험대 위에서 식혀준다. (5-10분)

④ 식힌 gel 용액에 Ethidium bromide (EtBr 20000x)를 1/20000 (10ul) 넣어 준다. (Etbr: DNA 이중나선 사이에 끼어 들어 자외선(UV)을 쬐면 형광을 냄. 독성이 강하므로 사용 시 주의할 것!)

==> 본 실험의 경우 EtBr 대신 독성이 없는 Red-safe 용액 (20000x) 을 이용함.

➄ Cast에 comb를 꽂아준 후 거품이 없도록 부어 굳힌다. (약 20분)

- Sample loading.

① 굳은 gel에서 comb을 제거한 후 1x TAE용액이 들어있는 전기영동 탱크에 gel판과 함께 넣어준다. (1x TAE용액은 전선과 gel보다 높이 채워져야 함.)

② PCR product (DNA)를 6x dye와 섞어서 well (comb으로 만들어진 홈)에 집어 넣는다. (4ul 6x dye를 20ul PCR product에 넣음)

③ well 하나에 product 크기를 비교할 수 있도록 기준이 되는 DNA ladder를 3ul 정도 넣어준다. (관찰하고자 하는 DNA size에 따라 100bp or 1kb ladder 사용.)

④ Voltage를 올려 전기가 흐르는 것을 확인 한다. (전선 주변에 거품이 올라옴.)

(주의, DNA는 –극을 띄므로 전기는 - → + 로 흐르도록 해야 함!)

➄ 100volt 사용시 15-20분 후, 전기를 끄고 조심스럽게 gel을 꺼내어 UV 조사기에 넣고 밴드를 확인한다.

※ DNA loading dye: 분자량이 큰 glycerol 등이 함유되어있어 DNA가 있는 시료를 가라앉히고 색깔을 내는 bromphenol blue 또는 xylene cyanol이 들어있어 전기영동을 하는 도중 DNA가 얼마나 내려갔는지 눈으로 확인할 수 있도록 도움.