< 생물학실험:  PCR을 이용한 유전자 증폭 >

실험재료

증류수, Template, 10x buffer(PCR 완충용액), 10mM dNTP, 5’ primer (10pmole/㎕) , 3’ primer (10pmole/㎕) ,Taq DNA polymerase(5U/㎕)

실험방법

1) 미리 10X Buffer와 dNTP, primer, template DNA를 서서히 녹인다.

2) 실험에 이용할 PCR 시험관에 다음과 같이 실험에 사용할 재료들을 혼합하여 잘 섞어준다. (Taq polymerase는 RT에 오래두지 않는다!)

* 여러개의 template를 비교할 경우 각 시약에 sample 개수 (+여분)를 곱한 만큼 넣어준 mixture를 만들어 PCR tube에 20㎕씩 분배함.

혼합순서→ ①		증류수	12.8㎕
②		10x buffer (PCR 완충용액)	2㎕
③		10mM dNTP	2㎕
Primers	④	5’ primer (10pmole/㎕)	1㎕
		3’ primer (10pmole/㎕)	1㎕
⑤		Taq DNA polymerase(5U/㎕)	0.2㎕
		Total volume	20㎕

3) 1㎕의 template를 각 PCR tube에 넣어준다.

(*negative control에는 DW를 1㎕ 넣어준다.)

4) PCR 반응액을 기계에 넣기 전에 centrifuge를 살짝 해서 tube 내벽에 묻은 반응액이 아래로 모이게 한다.

5) PCR 반응조건

Predenature	95℃	2 min
Denature	95℃	30 sec	30 Cycles
Annealing	62℃	40 sec
Elongation	72℃	30 sec
Post-Elongation	72℃	5 min
Stored	4℃